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2020年1月5日/医麦客 eMedClub/--通过基因工程来表达嵌合抗原受体(CARs)的T细胞，已经在某些B细胞白血病或淋巴瘤患者中证明具有令人印象深刻的治疗效果，在多发性骨髓瘤患者中也显示出了良好的疗效。然而，各种障碍限制和/或阻碍了CAR-T细胞疗法在这些患者以及其他癌症患者(尤其是实体肿瘤患者)中的疗效和广泛应用。与CAR-T细胞相关的主要挑战包括严重的毒性，肿瘤内的限制转运、浸润和激活，相对欠缺的体内持久性，抗原逃逸和肿瘤异质性，以及制造问题。
CAR设计超越传统结构的进展将是解决这些限制并将CAR-T细胞的使用扩展到更广泛的恶性肿瘤中所必需的。为了提高这种治疗方式的安全性、有效性和适用性，研究人员正在使用广泛的工程策略来解决当前的障碍。问题都是要一个一个解决，首先从CAR-T细胞治疗相关毒性问题开始。在许多临床试验中，包括很多成功的抗CD19 CAR-T细胞试验中，使用CAR-T细胞治疗的患者体内细胞因子水平几乎都出现了严重的、有时是致命的升高。这些效应反映了CAR-T细胞与肿瘤细胞和/或宿主免疫系统的细胞强劲的相互作用，导致CAR-T细胞活化和扩增，在一些患者中，免疫细胞交叉激活和系统细胞因子释放的恶性循环，可达到中毒水平。CAR T细胞主要毒性大致可分为两类：（1）与T细胞活化以及随后高水平细胞因子的系统性释放相关的毒性；（2）CAR与靶抗原之间的特异性相互作用所产生的毒性，这些抗原由非恶性细胞表达，称为（on-target/off-tumor）脱靶效应。今天，我们先来看看通过CAR的设计解决CAR-T细胞治疗系统性毒性问题的探索。这类毒性包括细胞因子释放综合征(CRS)、噬血细胞淋巴组织细胞增多症(HLH)和/或巨噬细胞活化综合征(MAS)，以及一种独特的神经毒性，现在称为免疫效应细胞相关神经毒性综合征(ICANS)。
CARs模块化设计有四个主要组件，分别是抗原结合域、铰链（Hinge）、跨膜结构域和胞内结构域。每一种组件都有其独特的功能，而CAR的最佳分子设计可以通过蛋白质结构域的多样化来实现。CAR结构（图片来源：参考来源2）
CAR的抗原结合域传统上是由可变重链（VH）、可变轻（VL）链及两者之间的柔性连接物（linker）形成的单链可变片段（single-chain variable fragment，scFv）。抗原结合域与一段起连接作用的铰链区（Hinge）构成了CAR的胞外结构域。抗原结合区识别靶抗原会触发一系列化学和生物理化过程，激活T细胞以杀伤肿瘤细胞。CAR以抗体的scFv（单链可变区）识别肿瘤抗原，从而实现独立于主要组织相容性复合物（MHC）的T细胞活化，scFv序列是CAR-T研发中的核心技术。铰链区（Hinge）能提供足够的灵活性来克服空间位阻，以便于结合靶抗原。跨膜结构域将CAR锚定在T细胞膜上。胞内结构域通常包括激活区、一个或多个共刺激域。基于对CAR的四个模块组件的创新设计，有望提高CAR-T细胞治疗的安全性和有效性，扩大其在肿瘤治疗领域的应用范围，促进快速、可靠和高效地生产CAR-T细胞。而对于CAR-T细胞治疗的首要问题--治疗相关毒性，为了在发生系统性细胞因子相关毒性事件时对抗这种效应，研究人员正在研究控制CAR表达或活性的工程性策略。
依赖于小分子衔接配体的CAR-T细胞开关：CAR可以被设计成识别双特异性衔接分子，这些衔接分子也包含与癌细胞上表达的受体(例如，叶酸受体)结合的分子，从而连接CAR-T细胞和癌细胞；这些半衰期短的小分子衔接器的剂量可以动态控制，以防止或终止CRS。（图Aa）具有潜在毒性的CAR-T细胞产品也可以通过各种“on-switches”进行控制，包括通过药物调节CAR结构的瞬时激活结构变化，例如不同肽链的二聚作用，包括解离、反式激活和共刺激域。（图Ab）
图A.依赖于小分子“On/off 开关”的CAR（图片来源：参考来源2）最近，Mestermann等人证明了酪氨酸激酶抑制剂dasatinib（已被FDA批准治疗费城染色体阳性慢性粒细胞白血病）通过抑制LCK干扰CAR活性，从而干扰CD3ζ激活域下游的信号。因此，dasatinib可迅速且可逆地阻止CAR-T细胞的激活。并且，在小鼠淋巴瘤模型中CAR-T细胞输注后不久(3小时)给予dasatinib，可显著降低CAR-T细胞诱导的CRS死亡率。如果这些观察结果在临床研究中得到验证，dasatinib可以提供一种现成的、可逆的、耐受良好的药理学安全开关，与许多其他安全开关不同，它不会导致CAR-T细胞的消失。（图Ac）另一种动态快速控制CAR-T细胞功能的策略涉及到使用基于蛋白酶的小分子辅助关闭CARs(SMASh-CAR)，也称为switch-off CARs (SWIFF-CARs)，来调控T细胞表面的CAR表达。在这个系统中，蛋白酶的目标位点和蛋白酶被嵌入到CAR结构中，与促进CAR蛋白降解的“degron ”片断一起。在“on”状态下，目标位点断裂，CAR蛋白中的“degron ”片段被去除，CAR在T细胞表面表达；而在使用外源性小分子蛋白酶抑制剂后，CAR蛋白没有被断开，“degron ”片段保留，从而CAR通过蛋白水解途径降解。（图Ad）因此，安全开关有望在毒性反应出现时消除CAR-T细胞；然而，在临床实践中，CAR-T细胞通常对皮质类固醇和化疗药物(如阿糖胞苷和氟达拉滨)敏感，这些药物在这些安全开关失效时提供可靠且广泛可用的支持。另一种控制CAR-T细胞这种毒性的策略是将“关闭开关”或“自杀基因”植入CAR结构，当细胞因子介导的毒性或脱靶效应发生时，提供一种方法使CAR-T细胞失活。这种方法主要是通过诱导细胞凋亡或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或互补依赖性细胞毒性(CDC)来消除CAR-T细胞。图B.“自杀基因”植入CAR结构（图片来源：参考来源2）
凋亡启动融合蛋白已被已开发成一种更快速的安全开关，该蛋白由caspase 9与FK506结合蛋白FKBP1A的修饰形式结合组成 (iCasp9)，后者通过与一种系统管理的生物惰性小分子AP1903结合能有条件的使融合蛋白二聚化和激活。在一项临床试验中，5名患者接受了同种异体造血干细胞移植治疗急性白血病，随后接受了iCasp9修饰的供体T细胞，以增强免疫重建;随后于4例发生移植物抗宿主病(GVHD)的患者中应用该二聚剂，在30分钟内清除了90%的修饰T细胞，并消除了GVHD，显示了该方法快速消耗CAR-T细胞的潜力。（图Ba）另外一些已经被开发出来的方法是基于CAR和人细胞表面抗原的共表达，FDA已经有批准的治疗性抗体，包括可以用rituximab（利妥昔单抗）靶向CD20，或者可以用西妥昔单抗靶向EGFR的胞外和跨膜结构域。（图Bb）敲除细胞因子基因或表达细胞因子拮抗剂。使CAR-T细胞先天具有分泌中和相关细胞因子的因子的能力，例如FcR（fragment crystallizable region receptor），GM-CSF（粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子），iCasp9（诱导型caspase 9），IL-1R（IL-1受体），IL-1Ra（IL-1受体拮抗剂），mAb（单克隆抗体），NK（自然杀伤细胞），scFv（单链可变片段），SMASh-CAR（小分子辅助关闭CAR）。图C.“自杀基因”植入CAR结构（图片来源：参考来源2）
目前，研究人员正致力通过各种策略于解决CAR-T这类极具潜力的治疗策略的应用障碍，而包括CAR-T细胞在内的整个生物制药市场也正处于急速发展阶段。在这里，还有一项值得关注的技术---大规模细胞培养技术被认为是生物制药的基石，是行业高速发展重要的关键环节。
包括CAR-T细胞在内的快速成长的生物制药产业对生产工艺提出了更高的要求，而细胞培养作为生物制剂生产制造的基础，是其中关键的一环，能够直接影响到其产品的市场竞争力。尤其大规模细胞培养是一项复杂的工作，采取合适的细胞培养工艺，是培养过程获得成功的关键。
为了共同推进生物制药研发和生产的进程，一些企业致力于提供这一关键技术的支持。其中英诺维尔智能科技(苏州)有限公司则从细胞培养必不可少的培养瓶（culture flask）出发，使细胞培养工作更快、更方便、更有效，尤其适用于大规模细胞培养技术。
英诺维尔公司设计生产的悬浮细胞培养瓶ImmunoVessel，该瓶身使用聚苯乙烯设计，一种生物相容性材料；应用了专利性的上下层透气膜技术优化培养瓶的透气性，此设计相较于传统Flask培养瓶可极大增加气体交换效率从而支持远高于传统培养瓶的细胞培养密度；该培养瓶使用γ射线辐照及医疗器械包装袋确保其无菌性。
细胞培养瓶最重要的是其透气性、生物相容性和无菌指标，透气性使得瓶内的气体能够维持合适的氧和pH水平，利于细胞呼吸和发生氧化还原作用，有利于细胞的生长繁殖；生物相容性是保证细胞高活率与高活性的重要关键。该公司设计的ImmunoVessel专门用于扩增悬浮细胞的培养瓶，除手工操作外，还可适配该公司ImmunoBase自动化平台大规模生产使用。
英诺维尔及其多家行业内知名客户，使用ImmunoVessel做了一系列实验，以验证该培养瓶的优秀性能。
首先，研究人员在ImmunoVessel中扩增不同Donor来源的CAR-T细胞，然后检测10天内的数据，结果发现这些CAR-T细胞可以高活率状态扩增200倍左右。并且在扩增期间，CAR分子阳性率维持不变，CD4 Th细胞及CD8 Tc细胞的比例同样保持稳定的状态，使得CAR-T细胞生长有数量优势和质量保证。
▲ 使用ImmunoVessel扩增不同Donor来源的CAR-T细胞
▲ CAR-T细胞制备过程中，CD4 Th细胞及CD8 Tc细胞的比例同样保持稳定的状态研究人员还进行了扩增CAR-T细胞体外药效的对比实验。结果发现，同传统培养瓶相比，用ImmunoVessel扩增出的CD19 CAR-T细胞具备同等的细胞因子释放水平及针对靶细胞的特异性杀伤能力。
在CAR-T细胞等生物制药的科学研发进展不断突破的情况下，我们希望生产制造的各方面工艺都能与之齐头并进，从而能更及时、高效的造福患者。细胞培养作为生物制剂生产制造的关键一环，能够直接影响到产品的研发生产进程和市场竞争力。英诺维尔的ImmunoVessel除传统培养瓶共有的优势外，还具有更好的透气性，并且培养密度也高于传统培养瓶。
试用培养瓶或代理意向请联系：
18761953357
0512-62620553
1.Mestermann, K. et al. The tyrosine kinase inhibitor
dasatinib acts as a pharmacologic on/off switch for
CAR T cells. Sci. Transl. Med. 11, eaau5907 (2019)2.https://www.nature.com/articles/s41571-019-0297-y
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